DNA剪切仪如何选？莱恩德DNA剪切仪在NGS文库制备中的应用优势

【一、分子生物学与基因测序行业实验检测背景与需求】

跟随准确医疗以及基因组学研究迅猛发展的步伐, 二代测序也就是NGS技术已然变成临床诊断、药物研发还有基础科研的核心工具, 依据行业标准, 在NGS文库制备进程之中, 决定后续测序质量的关键环节是DNA片段化, 传统的酶切法或者机械剪切法存在片段均一性糟糕、操作繁复、交叉污染风险高等诸多问题, 特别是在处理FFPE样本、微量DNA或者稀有样本时, 怎样在确保核酸完整性的前提条件下, 实现高重复性、窄分布范围的DNA片段获取, 这成为实验室所面临的普遍挑战。行业急切需要一种自动化DNA剪切设备, 它是非接触式的, 具备高通量特点, 且温控准确, 以此来满足NGS文库制备（WGS、WES）、ChIP-seq、ATAC-seq等前沿实验对样本前处理的严格苛刻要求。莱恩德DNA剪切仪正是针对这一需求所设计的专业解决办法。

 

【二、实验所需仪器与试剂】

核心仪器：莱恩德DNA剪切仪（型号LD-D100）

莱恩德LD - D100型DNA剪切仪运用非接触式超声波片段化技术, 借助超声波空化效果, 于封闭试管当中达成对DNA分子的精确打断。这个设备装备着7英寸医疗级别的液晶触摸屏, 它能够支持超声时间的灵活设定, 也可以支持间隙时间的灵活设定, 它同样支持超声功率的灵活设定, 还支持报警温度等参数的灵活设定, 并且它拥有样品温度的实时监测功能, 它也具备混频超声功能, 其频率会自适应到23KHz, 以此来确保不同GC含量的DNA样本能够得到理想的片段化效果, 也确保复杂结构的DNA样本能够获得理想的片段化效果。它的通量配置有着灵活性, 能够选择配备像30×0.2mL、20×0.5mL、8×2mL、5×5mL这样多种的混合支架, 用以满足从微量到中等通量的实验需求。另外, 该设备拥有外置低温水浴接口, 能够连接冷水机或者循环浴槽, 精确控制样品温度处于2至40℃的范围之内, 有效地防止因热损伤引发的样本变性。故障自动报警功能保证仪器运行安全且稳定。

 

配套试剂与耗材

核酸纯化后的DNA样本（推荐浓度10-200ng/μL）

具备低吸附特性的微量离心管, 其容量规格有0.2mL、0.5mL以及2mL, 需依据具体的支架规格来进行选择。

TE缓冲液（pH 8.0）或无核酸酶水用于样本稀释

DNA纯化磁珠或柱纯化试剂盒（用于片段化后产物回收）

低温循环水浴或冷水机（可选配，用于控温）

冰盒或低温冰浴装置（用于样本临时保存）

 

【三、标准实验操作方法】

样品前处理

把要进行剪切的DNA样本, 用TE缓冲液或者无核酸酶水, 稀释成所需要的浓度, 进行充分混匀之后, 转移到适配的微量离心管里头。要确保样本的体积, 不会超过试管容量的80%, 防止超声过程中液体溅出来, 或者产生气泡。对于FFPE样本或者低丰度样本, 建议先用DNA质量评估的方法（比如琼脂糖凝胶电泳, 或者Qubit定量）, 来确认样本的降解程度, 再酌情去调整起始的量。

 

仪器准备与设置

打开莱恩德LD-D100电源，进入触摸屏主界面。按照实验需求来设定参数, 对于超声时间, 建议刚开始设定为5到15分钟, 这要依据目标片段大小来确定, 单次超声时间设定成30秒, 间隙时间设定为30秒, 以此来防止样品过热, 与此同时, 超声功率推荐设置在200到400W之间, 需按照实际样本粘稠度进行调整, 报警温度设定为30℃。要是需要进行控温, 那就连接外置的冷水机, 设定水浴的温度为4到10℃。把装有样本的试管放置到适配的支架里边, 要保证支架可以正常工作的旋转电机, 也就是电池驱动的那种, 让试管在超声水槽内部均匀地旋转, 以此确保所有样本都能接受一致的处理。

 

实验操作步骤

将设备启动起来, 去点击那个被称作“开始”的按钮。仪器会自行开展预设好的超声程序。在这个过程当中, 能够借助触摸屏对样品温度以及超声状态做实时监测。要是察觉到温度快要接近报警值, 或者出现了异常的噪音, 那就得立马暂停程序, 瞅瞅样品密封得好不好, 或者水槽液位是否处于正常状态。等程序结束以后, 把试管取出来, 进行短暂的离心操作（转速为10000rpm, 时长10秒）来收集管壁上的液体。

 

数据采集与处理

将经过片段化的DNA样本, 按磁珠法或者柱纯化法来实施纯化操作, 进而把大片段以及小片段杂质予以去除。取适量已纯化的产物运用琼脂糖凝胶电泳或者微流控芯片电泳如Agilent 2100 Bioanalyzer进行检测, 以此评估片段分布范围比如主峰处于200 - 400bp区间且符合NGS文库构建要求。依检测的结果来看, 要是片段偏大的话, 那么能够适当地增添超声之时的时长亦或是功率；要是片段过小的话, 那就得降低处理强度。每进行一回实验, 建议涵盖阳性对照（也就是已知片段大小的那种标准DNA的呀）以及阴性对照（即无核酸酶的水的了）, 以此使结果可以被追溯过来的。

 

【四、实验结论与方案优势】

运用莱恩德LD-D100型DNA剪切仪开展DNA片段化实验, 可稳定获取处于200 - 400bp范围之内的均一性片段, 符合WGS、WES等主流NGS文库制备关于片段长度的严格要求。此方案于操作便捷性、数据重复性以及样本安全性方面展现出色: 非接触式设计全然规避了样本间交叉污染, 混频超声技术提高了对复杂序列的剪切效率, 准确温控系统切实保护了核酸完整性。对于基因测序公司, 还有医学检验所, 以及科研实验室来讲, 莱恩德DNA剪切仪能够明显提高文库构建效率, 还能降低人工操作误差, 与此同时, 它可以满足食品安全国家标准GB/T 37864 - 2019等法规针对生物样本前处理所提出的规范性要求, 是取代传统酶切法与接触式超声法的理想选择。

 

【五、参考文献/相关标准】

《食品安全国家标准》, 其中一项是关于食品微生物学检验的总则, 其标准编号为GB 4789.1 - 2016。

《核酸提取, 纯化以及片段化技术规范》, GB/T37864 - 2019。

用于二代测序的文库构建的通用技术规范, 此规范源自美国Illumina官方提供的文库制备指南。

, Sambrook, J. 以及 Russell, D.W. 于2001年出版了《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》第三版 , 由 Cold Spring Harbor Laboratory Press 出版。

针对非接触式超声DNA片段化, 展开方法学比较研究, （该研究发表于）《生物分子技术杂志》, 时间是2019年。